جداسازی و تهیه ساختار antisense ژن fae و انتقال آن به گیاه کلزا (brassica napus)

کلزا به عنوان یکی از مهمترین گیاهان روغنی دنیا محسوب می شود. کیفیت روغن حاصله از دانه کلزا به ترکیب اسیدهای چرب تشکیل دهنده آن بستگی دارد. ساخته شدن زنجیره های طویل اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع دارای مراحل مختلفی می باشد که هر یک از این مراحل توسط آنزیم یا آنزیم های متعدد کنترل می شود. تغییر در محتوای اسیدهای چرب روغن کلزا با استفاده از روش مهندسی ژنتیک نیازمند شناسایی، جداسازی و دستورزی در ژنهای درگیر در بیوسنتز اسیدهای چرب می باشد. اسید اروسیک (c22:1) یکی از مهمترین اسیدهای چرب تأثیر گذار بر کیفیت روغن کلزا می باشد، بطوریکه میزان بیشتر از 2 درصد آن باعث کاهش شدید کیفیت روغن خوراکی کلزا می گردد. تحقیقات نشان داده است که آنزیم -ketoacyl-coa synthase(kcs) ? آنزیم کلیدی در بیوسنتز اسید اروسیک می باشد. این آنزیم توسط ژن fae (fatty acid elongase) تولید می شود که تبدیل شدن اسید چرب c18 به c20 و c22 را عهده دار است. در این تحقیق جداسازی، همسان سازی، تهیه ساختار ژنی آنتی سنس و انتقال ژن سنتز کننده این اسید چرب به گیاه کلزا مورد بررسی قرار گرفت و به منظور خاموش نمودن ژن فوق و جلوگیری از سنتز اسید اروسیک، سازه آنتی سنس از این ژن (fae) تهیه شد. بدین منظور dna ژنومی گیاه کلزا به روش ctab استخراج و با طراحی یک جفت آغازگر و استفاده از روش pcr، ژن مورد نظر جدا گردید. قطعه 1521 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن با استفاده از هضم آنزیمی توسط آنزیمهای محدود گر ecorv)و (hindiii آنالیز و مورد تأیید قرار گرفت. به منظور تأیید نهایی، ژن جداسازی شده در ناقل عمومی psk کلون و با استفاده از آغازگرهای استاندارد تعیین توالی گردید و صحت آن مورد تأیید مجدد قرار گرفت. با توجه به هدف تحقیق که کنترل میزان تولید اسید اروسیک می باشد، سازه آنتی سنس ژن fae در جایگاه همسان سازی پلاسمید بیانی گیاهی pbi121 همسانه سازی شد. پلاسمید pbi121 نوترکیب به باکتری agrobacterium tumefacience سویه lba4404 وارد و از آن به منظور تولید سلولهای تراریخت و تولید گیاه تراریخت استفاده گردید. با وجود رشد گیاهان روی محیط حاوی کانامایسین از pcr با آغازگرهای اختصاصی، لکه گذاری نقطه ای و آنالیز سادرن برای تأیید انتقال ژن مورد مطالعه استفاده شد. خاموش شدن ژن fae توسط ساختار آنتی سنس منتقل شده باعث کاهش قابل ملاحظه میزان اسید اروسیک در گیاهان تراریخت b. napus گردید.